固定劑

固定劑最早用于光學(xué)顯微鏡，但光學(xué)顯微鏡使用的沉淀和凝集蛋白固定液并不特別適合電子顯微鏡。于是人們引入了四氧化鋨和中性甲醛進(jìn)行固定。在早期的電鏡生物樣品化學(xué)固定方法中，采用四氧化鋨進(jìn)行單一固定，但四氧化鋨不能很好地保存糖原等碳水化合物，四氧化鋨在組織中的滲出速度較慢（約2mm/h）

固定劑

電子顯微鏡使用的固定劑有毒，操作時(shí)要非常小心，盡量在通風(fēng)柜內(nèi)完成操作。如果固定劑在實(shí)驗(yàn)室泄漏，必須立即用大量奶粉覆蓋泄漏的溶液，待反應(yīng)充分后收集處理。

四氧化鋨（Osmium   Antimony trioxide）

四氧化鋨是一種強(qiáng)氧化劑，有淡黃色晶體，分子量254，飽和水溶液濃度為7.24%其水溶液呈中性，毒性極強(qiáng)。市場(chǎng)上有密封的四氧化鋨晶體和四氧化鋨水溶液兩種。四氧化鋨晶體在水中的溶解度很慢如果需要，可以使用超聲波設(shè)備來加速溶解。市場(chǎng)上已經(jīng)有準(zhǔn)備好的兩個(gè)了%四氧化鋨水溶液有賣，用起來挺方便的。但要特別注意的是，晶體和水溶液都會(huì)揮發(fā)四氧化鋨氣體，所以四氧化鋨要放在密閉的容器中（玻璃容器）中保存。四氧化鋨氣體對(duì)呼吸系統(tǒng)有刺激性，對(duì)眼睛有嚴(yán)重?fù)p害，使用時(shí)要特別小心，盡可能在通風(fēng)柜中，并嚴(yán)格控制用量。廢四氧化鋨溶液應(yīng)加入乙醇水溶液或硫酸亞鐵溶液，使四氧化鋨轉(zhuǎn)化為黑色沉淀，以降低毒性，便于收集和處理。四氧化鋨作為固定劑具有以下優(yōu)點(diǎn)：

1.四氧化鋨能與脂質(zhì)反應(yīng)、糖和蛋白質(zhì)反應(yīng)。其對(duì)脂質(zhì)的固定作用可以彌補(bǔ)醛類固定劑在脂質(zhì)固定方面的不足。

2.可以增加膜的對(duì)比度，發(fā)揮作用'電子染色'作用。用四氧化鋨固定的材料往往具有清晰的細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)。這是因?yàn)楸贿€原的鋨沉積在細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)上，鋨是原子序數(shù)較高的元素，可以增強(qiáng)它們的電子散射（質(zhì)量密度大）因此，四氧化鋨作為固色劑，還可以作為電子染料，使固色后的樣品圖像具有良好的對(duì)比度。

3.四氧化鋨會(huì)破壞大部分細(xì)胞膜的半透膜特性，所以配制四氧化鋨固定液時(shí)不必考慮滲透壓。

固定劑

四氧化鋨雖然有以上優(yōu)點(diǎn)，但也有很多缺點(diǎn)：

四氧化鋨滲透性弱，所以組織塊要小。否則組織塊從表面到中間會(huì)形成一個(gè)固定的梯度，導(dǎo)致內(nèi)部自溶過程繼續(xù)，造成組織塊內(nèi)固定不良。

糖原無法保存，核酸無法有效固定，微管固定效果不理想。

固定時(shí)間不宜過長(zhǎng)。時(shí)間過長(zhǎng)，組織會(huì)變脆，切片困難。此外，四氧化鋨和蛋白質(zhì)、不飽和脂肪酸交聯(lián)形成的絡(luò)合物易溶于水，特別是長(zhǎng)期固定后。因此，用四氧化鋨固定樣品12小時(shí)是合適的。

四氧化鋨能被乙醇或醛氧化－還原反應(yīng)，導(dǎo)致沉淀。因此，醛處理的樣品在用四氧化鋨固定前或用四氧化鋨固定后用乙醇溶液脫水前，必須用相應(yīng)的緩沖液充分漂洗。

四氧化鋨是酶的鈍化劑，所以它可以 它不能用于細(xì)胞化學(xué)的研究。

甲醛（formaldehyde）

固定劑

甲醛的分子中只有一個(gè)碳原子，含有一個(gè)醛基，分子式為$CH_分子量為30的2O。雖然市場(chǎng)上有許多形式的甲醛溶液，但它們含有少量的甲酸和甲醇，對(duì)固定樣品有不良影響適合電子顯微鏡固定的唯一溶液是多聚甲醛(Paraformaldehyde)新制備的甲醛溶液。甲醛溶液毒性很大，所以即使是稀釋劑也要格外小心。甲醛溶液對(duì)皮膚有硬化作用，長(zhǎng)期接觸可能導(dǎo)致皮膚破裂、皮炎或過敏癥狀；甲醛揮發(fā)性很大，對(duì)呼吸道也有影響長(zhǎng)期接觸甲醛氣體會(huì)降低嗅覺靈敏度；另外，甲醛對(duì)眼睛也有影響，也被認(rèn)為是致癌物。因此，在處理甲醛粉末或溶液時(shí)，必須非常小心，戴上手套，并在通風(fēng)柜中進(jìn)行。少量廢醛試劑（甲醛、戊二醛和丙烯醛等）可以在大量流水稀釋的情況下直接倒入池中（但要注意相關(guān)部門的相關(guān)規(guī)定）當(dāng)然，在大量流水的情況下，將少量醛類試劑與過量的1M甘氨酸混合后倒入池中更為安全。通常是100毫升甲醛(1%需要50毫升1M甘氨酸，100毫升1%戊二醛需要35ml，丙烯醛需要40ml。大量的醛類試劑必須回收并集中處理。

甲醛作為固定劑具有以下特點(diǎn)：

甲醛由于分子量小，穿透能力比戊二醛強(qiáng)，反應(yīng)溫和，因此可用于細(xì)胞化學(xué)研究中的預(yù)固定。而且不像戊二醛有兩個(gè)醛基，它引入組織和細(xì)胞的游離醛基較少，所以在一些組織化學(xué)研究中更有優(yōu)勢(shì)。但其反應(yīng)部分可逆，細(xì)胞基質(zhì)保存較差，脫水后大部分基質(zhì)丟失所以很多實(shí)驗(yàn)室不是單獨(dú)用甲醛固定樣品，而是和戊二醛混合制成固定液。

甲醛對(duì)生物樣品的作用類似于戊二醛，主要引起蛋白質(zhì)交聯(lián)。在水溶液中，單個(gè)甲醛分子以HO CH2 OH的形式存在。

與戊二醛不同，甲醛與DNA和核蛋白都發(fā)生反應(yīng)，但這些反應(yīng)是部分可逆的。另外，甲醛固定脂質(zhì)的能力不強(qiáng)，可與脂質(zhì)的蛋白質(zhì)效應(yīng)有關(guān)。

戊二醛（glutaric dialdehyde）

固定劑

戊二醛是一種含有兩個(gè)醛基的五羰基醛。分子式為$C_5H_8O_分子量為100的2美元。電子顯微鏡固定通常使用市售的25%將戊二醛水溶液稀釋至所需濃度。其pH為4.0$\sim$5.氧氣、高溫、中性或堿性pH會(huì)使戊二醛失去醛基，降低交聯(lián)效率，所以這種原液平時(shí)應(yīng)低溫保存。另外，戊二醛存放時(shí)間過長(zhǎng)，pH值會(huì)降低，顏色會(huì)變黃，固定效果也會(huì)大打折扣如果戊二醛的pH值降至3，.5或含有其他雜質(zhì)，使用前必須凈化。戊二醛能使皮膚變硬，但揮發(fā)性比甲醛弱，最好在通風(fēng)柜中操作。

戊二醛作為固定劑具有以下特點(diǎn)：

它反應(yīng)速度快，是一種優(yōu)良的預(yù)固定劑。但其滲出速度較慢，必要時(shí)配合甲醛使用效果更佳。

它是蛋白質(zhì)的強(qiáng)固定劑。它可以快速且不可逆地與氨基反應(yīng)，類似于甲醛戊二醛的醛基與氨基反應(yīng)，脫水后生成不穩(wěn)定的席夫鍵化合物。

因?yàn)槲於┯袃蓚€(gè)醛基，可以和另一個(gè)相鄰的氨基反應(yīng)產(chǎn)生交聯(lián)。戊二醛的兩個(gè)醛基也可以與相同的氨基反應(yīng)形成環(huán)狀結(jié)構(gòu)

這種環(huán)狀結(jié)構(gòu)可以進(jìn)一步與另一種戊二醛反應(yīng)，生成丁醛縮合物(Aldol   condensate)這種化合物與氧分子相互作用產(chǎn)生穩(wěn)定的嘧啶衍生物(Pyridine   derivative)并且在該過程中發(fā)生交聯(lián)。

固定劑

與甲醛不同，戊二醛反應(yīng)的這一步是不可逆的，需要氧氣的參與。由于大樣本供氧不足，戊二醛在大樣本中不能形成穩(wěn)定的產(chǎn)物，會(huì)導(dǎo)致在樣本中固定效果不佳。因此，戊二醛用于固定時(shí)，小樣本的固定效果較為理想。戊二醛通過交聯(lián)固定蛋白質(zhì)的過程會(huì)伴隨著氫離子的釋放，使樣品的pH值降低。為了將pH值穩(wěn)定在最佳水平，應(yīng)在戊二醛固定劑中加入足量的緩沖液。

戊二醛可以通過固定核蛋白來固定組織和細(xì)胞中的DNA和RNA，保存糖原，也可以固定與蛋白質(zhì)有關(guān)的或含有氨基和亞氨基的脂質(zhì)。然而，單獨(dú)用戊二醛固定的樣品不能防止隨后的脫水、樣品的脂質(zhì)是通過浸潤(rùn)包埋工藝提取的，因此固定細(xì)胞膜的效果并不理想。

戊二醛在固定過程中不會(huì)完全破壞細(xì)胞膜的半透膜特性，因此需要選擇合適的固定液滲透壓，避免出現(xiàn)固定錯(cuò)覺。然而，很難找到一個(gè)通用的滲透壓，因?yàn)楣潭ㄈ芤旱倪m當(dāng)滲透壓隨著固定細(xì)胞和緩沖液的類型而變化。實(shí)際上，1美元.2.5\$戊二醛（使用0.1M磷酸鹽緩沖液或0.1M二甲基胂酸鹽緩沖液）總的來說，它已經(jīng)能夠提供理想的固定效果。除非觀察到明顯的滲透壓引起的錯(cuò)覺，一般不會(huì)特別調(diào)整靜止液體的滲透壓。